【基础知识】什么，你都还不懂测序？（2）第二代测序

前言

有小伙伴留言，整理一些测序相关的入门级科普。所以，前段时间，腾讯，我们介绍了第一代测序，Sanger测序法。

【基础知识】什么，你都还不懂测序？（1）Sanger测序法

现在我们继续介绍第二代测序吧，同时对比一下二代测序和第一代测序的优缺点。

正文

第二代测序，又称下一代测序（Next-generation sequencing，NGS）。简单说来，第二代测序是依赖于PCR文库构建、激光探头读取荧光信号的短读长测序。目前最常见的平台包括Illumina和BGI（华大基因），所以在本文中我们主要就介绍这两个平台的测序原理。同时，基于二代的10X linked-read测序是对二代技术的改进，略作讲解。

1. Illumina：边合成边测序（Sequencing by Synthesis）

原理基于PCR，当在Flowcell中加入不同荧光标记的dNTP（区分ATGC）和酶，由引物起始开始合成子链。但是dNTP存在 3’端叠氮基团会阻碍子链延伸，这使得每个循环只能测得一个碱基。合成完一个碱基后， Flowcell 通入液体洗掉多余的dNTP和酶，使用显微镜的激光扫描特征荧光信号。

整个过程包含样本制备（Sample Prep）、成簇（Cluster generation）、测序（Sequencing）等步骤，每步的具体方法不多说，可以看看视频大概了解一些。

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视频材料1：Illumina边合成边测序原理视频

2. BGI：联合探针锚定聚合技术（cPAS）和改进的DNA纳米球（DNB）核心测序技术

单链DNA会缠绕成一个纳米球，纳米球可自动附着于有整齐的固定点的芯片上而不相互堆叠（即阵列技术），随后利用组合探针锚定连接法测序。

整个过程包含样本准备（形成末端修复的DNA片段）、片段扩增（加接头序列、形成单链DNA、成环、滚环扩增形成DNA纳米球）、纳米球附着于芯片并使用cPAS法测序。具体原理参见文献：Science 327, 78 (2021)。[1]

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视频材料2：BGI cPAS-DNB测序原理视频

3. Illumina和BGI比较

BGISEQ500和Illumina NEXTSEQ500对比[2]

4. 二代测序技术与一代测序技术的比较

一代：准确性高（~0.1%ER）、读长较长（~1kb）、通量低、价格昂贵。

二代：准确性较高（1~1.5%ER）、读长较长（150~600bp）、通量高、价格便宜。

5. UPDATED 2ND SEQUENCING: 10X GENOMICS LINKED READS

10X是通过改善建库流程，对同一HMW DNA模板加Barcode后分到不同的液滴，将每个液滴中的DNA分子打断后测序，随后再组装，从而通过二代测序技术对小片段测序后组成成长片段（linked reads）。参见Nat Biotechnol. 2021 March ; 34(3): 303–311。[3]

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10X linked-read sequencing技术

6. 二代测序的不足

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