专利名称：癌症化学预防剂的制作方法
技术领域：
本发明系关于2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯和其药物学上可接受的盐做为癌症化学预防剂的新用途。
多数抗癌药是用于癌症病人的化学治疗，但人们近来已经在试图研制癌症的化学预防剂。癌症化学预防剂，像此处所用的，系指在预防癌症中有效的化合物或含有相同活性成分的药物组合物。
许多化合物，包括原来为其他治疗目的而开发的一些化合物，现已知具有癌症化学预防活性。例如奥替普拉(oltipraz)，5-(2-吡嗪基)-4-甲基-1，2-二硫醇-3-酮，起始用为抗血吸虫病药，后发现其具有抑制化学诱导致癌作用的效用，现正由美国国家癌症研究中心开发为一种癌症化学预防剂[见V.R.Chinthalapally，K.Tohomo，G.Kelloff and B.S.Reddy，Careinogenesis，12，pp，1051-1055(1991)]。
本发明者以前曾开发了硫代乙烯酮衍生物及其无毒性的盐，它们具有优良的治疗和预防肝脏疾病的活性(见美国专利No.5,103,013)。在这些化合物中，十分意外地发现2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯及其药物学上可接受的盐具有优良的癌症化学预防活性。
因此，本发明的首要目的是为2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯及其药物学上可接受的盐提供作为癌症化学预防剂的新用途。
依据本发明，此处提供一种2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯及其药物学上可接受的盐在制造预防癌症的药物中的新用途。
本发明的上述和其他目的及特征可从下列的描述，连同附图一起看将变得明显，其中，
图1显示2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯对由氨基甲酸乙烯酯所诱导的TA98和TA100突变的影响。
通式(I)的2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯和其药物学上可接受的盐可应用效突变试验，DNA共价结合试验和小鼠皮肤癌试验来测定它们的癌症化学预防活性。 苯并(a)芘(一种环境致癌物的原型，“B[a]P”)可被单氧合酶，特别是在细胞色素PIA和细胞色素P3A--细胞色素P45-(CYP)的亚族--中的单氧合酶致活形成一个亲电的环氧化物，即苯并[a]芘-7，8二氢二羟基-9，10-环氧化物(BPOE)，此化合物具有致突变和致癌活性[见J.M.Sayer，Whalen and D.M.Jerina，Drug Metab.Rev.20，pp 155-182(1989)]。此外，氨基甲酸乙烯酯(VC)被细胞色素P2E1活化为亲电的和有致癌作用的最终环氧代谢物(VC环氧化物)[见F.P.Guengerich，D.H.Kim and M.Iwasaki，Chem.Res Toxicol.，4，PP 168-179(1991)] 。
2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯及其药物学上可接受的盐，如试验范例所描述的，能够有效地抑制由苯并[a]芘，苯并[a]芘-7，8二氢二羟基-9，10-环氧化物，氨基甲酸乙烯酯和氨基甲酸乙烯酯环氧化物诱导的突变；苯并[a]芘与DNA的结合；和小鼠皮肤癌。据此，2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯及其药物学上可接受的盐可用于预防癌症。
2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯及其可做为药用的盐可用美国专利No.5,103,013所描述的方法容易地制得。
本发明还提供一种包含有效量的2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯或其药物学上可接受的盐以及可做为药用载体的预防癌症药物组合物。
按照本发明，药物组合物可用药物学上可接受的载体制成各种剂型。能在本发明中应用的药物学上可接受的载体包括，但不限于此，适当的稀释剂，溶剂，填充剂，结合剂，网易，分散剂，崩解剂，表面活性剂，润滑剂，赋形剂和湿润剂。如需要时本组合物还可进一步包括增溶剂，缓冲剂，防腐剂，着色剂，香料，甜味剂和同类物。
本发明的药物组合物剂型可按照希望的用药方式制备。例如口服剂型像片剂，胶囊和颗粒，可应用习用的方法用稀释剂(如蔗糖，乳糖，葡萄糖，淀粉，甘露醇)，结合剂(如糖浆，阿拉伯胶，山梨醇，黄蓍胶，羟丙基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，淀粉糊)；崩解剂(如淀粉，羧甲基纤维素或其钙盐，微晶纤维素，交联聚乙烯吡咯烷酮，淀粉-甘醇酸钠)；润滑剂(如滑石粉，硬脂酸镁，硬脂酸钙，二氧化硅)；湿润剂(如十二烷基硫酸纳，甘油)和同类物制备。
本发明进一步提供一种通过将有效量的2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯及其药物学上可接受的盐施用于主体从而在主体内预防癌症的方法。
剂量可随用药方法和剂型，以及年龄，体重，病人的状态和敏感性不同而变化。在口服用药的情况下，有效的日剂量范围，例如，可从20mg至1g。单剂量单位含2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[-N(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯及其药物学上可接受的盐的量为由20mg至200mg，可方便地用来符合日剂量的需要。使用的剂量和剂量单位可超出上述范围。
下列的试验例和实施例是为了说明本发明某些方面的目的，在任何方面都不应被认为是限制本发明的范围。
试验例1突变试验
2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯对由B[a]P，BPDE，VC和VC环氧化物诱导的突变的癌症化学预防活性如下进行评价。
雄性Sprague-Dawley大鼠(鼠龄40至45天)在标准条件下(12h白天-12h黑夜循环，温度21±2℃)用标准实验室饲料块和水随意喂养。在处死前连续五天在腹膜内注射阿罗克乐(Aroclor)1254(溶于玉米油中500mg/kg)。大鼠以CO2窒息处死，立即取出它们的肝脏并原地浸泡于冰冷的KCl等渗溶液中。肝组织经称重后切碎，并在三倍体积的冰冷0.25M蔗糖溶液中用电动的Potter-Elvehjem玻璃-Teflon匀浆器做成匀浆。匀浆在9000×g离心30分钟，上清液(S9部分)用做酶的来源。1-1.由B[a]P诱导的突变Ames His+逆转分析是按照液体预孵育法用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)TA98和TA100做为试验株进行的[见D.M.Maton and B.N.Ames，Mutation Res.，113，pp173-221(1983)]。
TA98和TA100(1至2×109/盘)分别与溶于DMSO的2.5μg B[a]P一起加入到上述获得的由阿罗克乐1254诱导的含有NADPH产生系统的鼠肝后线粒体(postmitochondrial)上清液中(50μg约等于2mg蛋白质)。向其中加入不同量的2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯并在37℃预孵育20分钟。
混合物用软琼脂稀释，倾在硬琼脂盘上，再孵育48小时以使His+逆转菌落生长。所得数据用自发逆转数校正。结果见表1。
表1
*化合物2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯1-2.由BPDE诱导的突变Ames His+逆转分析是按照液体预孵育法用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)TA100做为试验株进行的[见D.M.Maton and B.N.Ames，Mutation Res，113，pp173-221(1983)]。
25nmol的BPDE与鼠伤寒沙门氏菌TA100在无或有给定量的2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯存在下在37℃一起孵育20分钟。
然后，混合物用软琼脂稀释，倾于硬琼脂盘上，再孵育48小时以使His+逆转菌落生长。结果见表II所示。数据以两次分析的平均值表示。
表II
*化合物2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯1-3 由VC诱导的突变重复例1-1的操作方法，不同之处在于，鼠伤寒沙门氏菌TA100和TA1535为试验株，氯基甲酸乙烯酯(10μmol)做为致突变剂并使用2.5μg和25μg的2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯本品对VC所诱导的突变的作用示于图1。1-4 由VC环氧化物诱导的突变重复例1-2的操作方法，不同之处在于，鼠伤寒沙门氏菌TA100为试验株外，并用氨基甲酸乙烯酯(25和50nmol)做为致突变剂。
本品对VC环氧化物所诱导的突变的作用示于表III。
表III
*化合物2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯如表I，II，III和图1所示，2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯能剂量依赖地抑制由原型致突变剂，即B[a]P，BPDE，VC和VC环氧化物所诱地细菌突变。试验例2.共价结合试验含0.25μg[3H]-B[a]P(特异活性12.35mi/mmol的50mM磷酸钾缓冲液(PH7.4)，2mg小牛胸腺DNA，25mgDTA，NADPH(0.65mM)和4mg肝后线粒体上清液的混合物2ml与不同浓度的2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯一起在37℃孵育30分钟。
在去除蛋白质后用乙醇沉淀析出DNA。由此得到的DNA小球顺序地用含1％NaCl的75％乙醇，75％乙醇，无水乙醇，丙酮和乙醚冲洗，然后干燥。
干燥的DNA样品溶于15mM NaCl-1.5m柠檬酸钠缓冲液(PH7.0)中。DNA的浓度以二苯胺方法测定，用小牛胸腺DNA做标准[见K.Burton and G.B.Peterson，Biochem J.，75，pp17-27，1960]。
等分的DNA溶液溶于Sovable(Dupont/NEN Rosearch Products，Boston，MA)中。以冰酯酸中和后，共价地结合在DNA上的放射性标记烃类在加入Liquescent(National Diagnostics，Manville，NJ)后像一种鸡尾酒，用液体闪烁计数器测定其水平。结果示于表IV。
表IV
*化合物2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯如表IV所示，2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯能剂量依赖地抑制B[a]P对小牛胸腺DNA共价结合。试验例3.小鼠皮肤癌试验也研究了2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯对小鼠皮肤癌的抑制作用。二烯丙基硫醚是已知具有癌症化学预防活性的化合物，它被用来做比较。3-1 由VC诱导的致癌作用雌性ICR小鼠(鼠龄6至7周)的背部剃毛。30支小鼠为一组以2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯2.5μmol溶于0.2％羧甲基纤维素钠的溶液处理，或以8μmol二烯丙基硫醚溶于0.1M灭菌的磷酸钾缓冲液的溶液处理。10分钟后，小鼠以VC(5.8μmol)溶于含有15％DMSO的0.2ml丙酮溶液局部给药。对照组则仅给以VC。
起始给药后一周，小鼠以15nmol TPA(12-O-十四烷酰基佛波醇-13-醋酸酯)溶于0.1ml的丙酮溶液局部给药，一周两次以加速致癌过程。
间周计数并记录直径至少为1mm的肿瘤。结果示于表V。括弧内的数字为荷肿瘤的小鼠％。
V
*化合物2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯3-2 由B[a]P或VC诱导的致癌作用雌性CD-1小鼠(鼠龄6周)在腹膜内注射B[a]P(0.3μml)或VC(11.5μmol)溶于0.2ml丙酮的溶液或只给以同体积的丙酮前24小时和1小时，用胃管饲法给以三辛偶姻(Trioctanoin)，或2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯混悬于三辛偶姻(0.15mg/10μl/克体重)的混悬液或二烯丙基硫醚混悬于三辛偶姻(0.2mg/10μl/克体重)的混悬液。
起始给药后一周，动物以15nmol TPA(12-O-十四烷酰基佛波醇-13-醋酸酯)溶于0.1ml丙酮的溶液局部给药，一周两次以促进致癌作用。
在起始给药后16周计数并记录直径至少为1mm的肿瘤。结果示于表VI。
表VI
*化合物2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯如表V和表VI所示，以2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯预处理能有效地减少由B[a]P和VC诱发的皮肤癌。
在本发明关于特殊具体化的描述时，必须认识到由本领域熟练人员对本发明所做的各种修改和改进也应属于所附权利要求所界定的本发明的范围之内。
权利要求
1.2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯及其药物学上可接受的盐在制备预防癌症的药物中的一种用途。
全文摘要
2-(1，3-二噻四环-2-亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸异丙酯及其药物学上可接受的盐在制备预防癌症的药物中的一种用途。
文档编号C07D417/00GK1151865SQ96120319
公开日1997年6月18日 申请日期1996年10月14日 优先权日1995年10月14日
发明者李钟郁, 俞重根, 李相昊 申请人:株式会社柳韩洋行